Olika typer av fluorescensmikroskop

När mikroskop utvecklades runt 1600 e.Kr. fann naturfilosofer en ny värld. Antony van Leeuwenhoek, med sina små, kraftigt böjda linsar och en mekanisk holder, öppnade fönstret mot mikrovärlden av bakterier, blodkroppar, protister och växternas cellstruktur. Genom århundradena har en enhetlig fråga följt: vad är dessa märkliga objekt som vi ser genom ett lins? Fluorescensmikroskopi eliminerar osäkerheten – när ljus riktas på ett prov, återstrålar provet sitt eget ljus.

Epifluorescens

Epifluorescens är den mest använda konfigurationen. Ett ljuskälla – oftast en kvicksilver- eller xenonlampa – bryts genom ett filter som väljer ett smalt våglängdsband. Det filtrerade ljuset träffar provet via objektivlinsen. Fluoroforer absorberar kortvågigt ljus och emitterar långvågligt ljus. Ljuset från fluoroforerna, tillsammans med spritt ljus från lampan, reflekteras tillbaka in i objektivet och vidare till detektorn eller ögat. Ett ytterligare filter blockerar lampans ljus så att endast det fluorescerande ljuset når mottagaren.

Konfokal

Vid epifluorescens samlas ljus från hela synfältet. Excitationsljuset absorberas före, i och efter fokuspunkten, vilket ger en bild med både fokuserat och otydligt ljus. En konfokal mikroskop fokuserar en laserpunkt på samma plan som mikroskopet fokuserar. Ett pinhol in i fronten av detektorn blockerar all icke-fokuserad stråle. Genom att skanna provet kan man erhålla en ren tredimensionell bild.

Multiphoton

Multiphotonmikroskop eliminerar känsligheten för justeringar. Det använder en laser med halva energinivån för att exciterar fluoroforer. Fluoroforerna exciteras bara när två fotoner träffar dem samtidigt, vilket sker vid mycket liten punkt. Därför emitterar endast området där lasern fokuseras ljus, vilket ger en ren bild utan behov av ett pinhol.

Total intern reflektion (TIRF)

TIRF ger rena bilder genom att begränsa excitationen till ett mycket tunt lager nära ytan. Ljuset riktas horisontellt genom glasytan, så att endast en tunn skikt av lösningen – där celler ofta klibbar – får ljuset. Endast områden i närheten av glasytan emitterar ljus, vilket är särskilt användbart för studier av neuroner där yten är kritisk.

Superupplösning

Alla mikroskop, inklusive fluorescensmikroskop, begränsas av diffraktionens gräns – cirka 200 nm för synligt ljus. Enstaka molekyler är bara några nanometer stora, så många strukturer ligger under denna gräns. Forskare utvecklar "superupplösning" som SIM (strukturerad belysning) och STED (stimulerad emissionsdepletion) för att minska storleken på den lysande punkten och överträffa diffraktionsgränsen.