Typer av fluorescensmikroskop

När mikroskop uppfanns omkring år 1600 v.t. naturfilosofer riktade blicken mot en värld inom en värld. När Antony van Leeuwenhoek skapade små, högböjda linser och en mekanisk hållare för att justera utsikten, han öppnade ett fönster mot bakteriens mikroskopiska värld, blod celler, protozoer och växternas cellulära struktur. Men genom mikroskopins historia, det har alltid funnits en fråga:Vad är det för konstiga saker man ser genom ett objektiv? Fluorescensmikroskopi hänvisar till en uppsättning tekniker som minimerar den osäkerheten - för i fluorescensmikroskopi när ljuset lyser på ett prov, det lyser sitt eget ljus direkt tillbaka.

Epifluorescens

Det klart vanligaste fluorescensmikroskopet är epifluorescens -konfigurationen. I ett epifluorescensmikroskop, en ljuskälla - typiskt en kvicksilver- eller xenonlampa - lyser genom ett filter som väljer ett trångt område av våglängder. Det filtrerade ljuset lyser på provet genom mikroskopets objektivlins. Det inkommande ljuset absorberas av fluoroforer - molekylära etiketter som avger ljus med en lång våglängd när de absorberar ljus med en kortare våglängd. Ljus från fluoroforerna, tillsammans med spritt ljus från belysningskällan, går tillbaka in i objektivlinsen och till detektorn eller ögat. Längs vägen, ett annat filter blockerar belysningen, så allt som återstår är det fluorescerande ljuset från provet.

Konfokal

Ett epifluorescensmikroskop samlar in ljus överallt från mikroskopets synfält. En del av excitationsljuset absorberas före mikroskopets fokalplan, några vid brännplanet och några bortom brännplanet. Eftersom mikroskopet samlar allt det ljuset, bilden kommer att innehålla en skarp bild av ljus vid fokus, men det kommer också att ha oskärpt ljus från andra regioner. Ett konfokalt mikroskop fixar det genom att fokusera en laserpunkt i samma plan som mikroskopet är fokuserat. Sedan, ett nålhål går framför detektorn, där det blockerar allt ljus som inte kommer från mikroskopfokus. Genom att skanna provet, en ren tredimensionell bild av objektet kan erhållas.

Multiphoton

I ett konfokalt mikroskop är inriktningen mycket känslig. Om laserpunkten, mikroskopets mål, samlingsoptiken och nålhålet är avstängd även den minsta mängd mikroskopets prestanda lider. Ett multiphotonmikroskop tar sig runt detta problem genom att använda en laservåglängd som bara är hälften så energisk som den behöver vara för att excitera fluoroforerna i provet. Det enda sättet fluoroforerna kommer att bli upphetsade och avge fluorescens är om laserljuset är tillräckligt starkt så att två ljuspartiklar - fotoner - träffar fluoroforen på mycket kort tid. Det händer bara när lasern är fokuserad på en mycket liten plats. Så den enda platsen i provet som kommer att avge ljus är där lasern är fokuserad, som håller bilden snygg och ren eftersom det inte finns något extra bakgrundsbelysning att bli av med - vilket betyder att inget nålhål ska justeras.

Total intern reflektion fluorescens (TIRF)

Ett annat sätt att få väldigt rena bilder är att se till att excitationsljuset inte kommer särskilt långt in i provet. Om en klump neuroner, till exempel, läggs i en droppe lösning på en glasskiva, då kommer några av neuronerna att fästa vid glasytan. I ett totalt internt reflektionsfluorescensmikroskop (TIRF) riktas ljuset i sidled in i glasskivan så att det inte kommer in i lösningen som håller cellerna. Men en del av ljuset läcker bara knappt in i lösningen - bara mycket nära glasytan. Detta betyder att de enda platser som kommer att avge ljus kommer att vara i ett mycket tunt område precis upp mot glasytan. För något som neuroner, där det händer så mycket intressanta saker på ytan av cellerna, denna teknik kan vara mycket effektiv.

Superupplösning

Alla mikroskop - inklusive fluorescensmikroskop - begränsas av den fysik som styr ljusets spridning. En av de grundläggande reglerna är att en fokuserad ljuspunkt bara kan bli så liten - och inte mindre. För synligt ljus, den storleken är cirka 200 nanometer, eller 200 miljarder av en meter. Men enstaka molekyler är bara några nanometer stora, så det finns många intressanta funktioner som ligger under den storleksgränsen, kallas diffraktionsgränsen. Forskare utvecklar "superupplösta" tekniker för att smyga runt den gränsen. Strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) och stimulerad utsläppsminskning (STED) mikroskopi, till exempel, är båda fluorescensmikroskopimetoder som begränsar storleken på den ljusemitterande fläcken genom att krympa storleken på excitationsljusfläcken.